On ne sait pas grand chose de la vie de Lotto sinon qu'il subit l'influence de Giovanni Bellini à ses débuts sans être cependant son élève.
Il travailla également sous d'autres influences, notamment celles de Giorgione ou Léonard de Vinci et se serait lié d'amitié avec Palma il Vecchio qui avait un tempérament aussi doux que le sien.
"Portrait d'un couple marié" 1523
Des historiens ont affirmé qu'il avait travaillé avec Vinci, ce qui n'a pu être vérifié mais ce fut surtout à Venise qu'il exerça d'abord ses talents en révélant un don de miniaturiste. D'ailleurs, il illustra de précieux manuscrits pour des communautés religieuses.
On le trouva également à Trévise en 1505 et dans des localités environnantes où il produisit des tableaux pour des églises dans un style plutôt hiératique puis il fut invité en 1509 à Rome pour travailler aux Stanze mais fut renvoyé dès l'arrivée de Raphaël dont il essaya d'imiter le style.
En 1513, devenu plus expérimenté dans le traitement du dessin et des couleurs, il fit halte à Bergame et peignit «La Vierge aux Quatre Saints» pour l'église San Bartolommeo, une œuvre qui suscita l'admiration des habitants de la ville.
Lotto produisit de nombreux tableaux pour des églises de Bergame et de ses environs en y mettant une touche très personnelle, innovant dans le registre de la représentation des Madonnes italiennes et des Vierges entourées de saints et d'anges en jouant également sur les effets de perspective et trouvant un style propre avec ses figures d'anges aux formes gracieuses.
Il travailla également dans les Marches d'Ancône et notamment à Lorette mais Venise demeura le centre de son activité même si fit Le Titien lui fit quelque peu de l'ombre.
Lotto peignit de nombreux portraits non dépourvus de charme bien coloriés mais envahissant peut-être trop la toile. Le Musée du Louvre possède un de ses chefs d'œuvre, «La Femme Adultère», où les oppositions de couleurs sont saisissantes et donnent une vibration intense à ce tableau.
Lotto visita également Parme et fut probablement influencé par les œuvres du Corrège comme dans «Le Mariage de Sainte Catherine» peint en 1523 (actuellement à Bergame).
Il termina sa carrière dans les Marches, peignant en 1550 une «Annonciation» à Ancône puis se retira à Lorette où il produisit une «Ascension» mais quoiqu'il en fut, il resta essentiellement vénitien tout au long de sa carrière, par l'intensité de ses coloris, la richesse des costumes et les fonds de paysage bien que sa touche restât plutôt timide, en accord cependant avec la représentation idéalisée de ses anges.